Diagnostika MMR deficitu, MSI a MMR zárodočnej mutácie

V prípade klinicko-patologického podozrenia na MTS sú nevyhnutné ďalšie laboratórne vyšetrenia na potvrdenie alebo vylúčenie MMR deficitu a MSI. Senzitivita vyšetrení nestability mikrosatelitov založená na PCR metóde versus imunohistochemické vyšetrenie je zhodná. Prvým krokom skríningového testu je imunohistochemická štúdia expresie MMR proteínov, ktorá predstavuje rýchlu, efektívnu a spoľahlivú metódu s vysokou prediktívnou hodnotou diagnózy MMR deficitu [42]. Patern expresie MMR proteínov v kožných tumoroch koreluje s molekulárno-genetickými výsledkami. Strata expresie týchto proteínov je indikátorom pravdepodobného zárodočného defektu MMR génu a s tým spojené MSI (obr. 12) [42]. V našej rutinnej praxy používame štandardne panel štyroch protilátok (MLH1, PMS2, MSH2, MSH6), hoci nedávne štúdie poukázali na možnosť použitia iba 2 protilátok (MSH6 a PMS2), ktorých prediktívna hodnota je údajne zhodná ako pri vyšetrení s použitím 4 protilátok pokiaľ sa vezmú do úvahy biochemické vlastnosti MMR proteínov, ktoré tvoria vyššie spomenuté heterodiméry MLH1/PMS2 a MSH2/MSH6 [48]. MLH1 a MSH2 sú tzv. základné proteíny, zatiaľ čo PMS2 a MSH6 predstavujú tzv. sekundárne proteíny. Abnormality v základných proteínoch (MLH1, MSH2) vedú k proteolytickej degradácii heterodimerov a následne ku strate základných aj sekundárnych proteínov. Pokiaľ sa mutácia vyskytne v génoch sekundárnych proteínov (gény PMS2, MSH6), heterodiméry zostávajú stabilné a nedochádza k súčasnej strate ich partnerov, t.j. základných proteínov. Preto v prípade použitia dvoj-protilátkového panelu je nutné vždy myslieť na to, že väčšina prípadov so stratou MSH6 proteínu môže mať defekt v MSH2 géne, zatiaľ čo v prípadoch so stratou PMS2 proteínu môže byť naopak genetický defekt v MLH1 géne. Ak sa využije 4-protilátkový panel, často je strata MLH1 alebo MSH2 spojená so stratou PMS2 a MSH6 proteínu.

Niekoľko postrehov k imunohistochemickému vyšetreniu expresie MMR proteínov vedúcich ku stanoveniu alebo vylúčeniu MMR deficiencie:

Sporadické sebaceózne lézie môžu príležitostne demonštrovať stratu MMR proteínov [49, 50].
Niektorí pacienti môžu mať zárodočnú mutáciu, ktorá sa neprejavuje stratou MMR proteínov v tumore. Taká situácia môže nastať u niektorých zárodočných missense mutácií vedúcich ku expresií nefunkčných, ale antigénovo intaktných proteínov. [51, 42].
U rôznych sebaceóznych tumorov jedného pacienta je očakávaný identický farebný vzor. Z tohto dôvodu postačí na testovanie osôb s mnohopočetnými prejavmi na koži len jedna lézia [10, s40]. Treba však zdôrazniť, že sebaceózna hyperplázia zvyčajne nevykazuje stratu MMR proteínov, hoci ostatné typy sebaceóznych tumorov u rovnakého jedinca (napr. sebaceózny adenóm, sebaceózny karcinóm) simultánne demonštrujú MMR deficienciu [10]. Predpokladaným nálezom je tiež imunohistochemická zhoda medzi všetkými tumormi od jedného pacienta vrátane kožných a viscerálnych tumorov, avšak vzácne môže byť pri kožných a viscerálnych tumoroch detegovaný rozdielny obraz imunohistochemického vyšetrenia MMR proteínov [52].
Pomocou imunohistochemického vyšetrenia sa nedá rozlíšiť rozdiel medzi stratou MLH1 expresie spôsobenej zárodočnou mutáciou versus somatickou hypermetyláciou promotora [51].
Známym a často diskutovaným faktom je existencia rôznych kvalít farbenia vrátane tzv. slabého farbenia neoplastických elementov a nedostatku presvedčivo pozitívnej internej kontroly. Niektorí autori zastávajú názor, že iba kompletná strata expresie MMR proteínu v nádorovom tkanive s valídnou pozitívnou kontrolou môže byť považovaná za interpretovateľnú. Podľa našich skúseností je možné zaznamenať parciálnu stratu expresie MMR proteínu, niekedy s nápadným gradientným profilom (t.j. strata farbenia v centre lézie s naopak pozitívnym, aj keď len slabým farbením na periférii tumoru) [42]. V problematických prípadoch je odporúčané vyhodnotenie vzorky najmenej dvoma patológmi, ktorí majú skúsenosti s interpretáciou imunohistochemických nálezov MMR proteínov. Napriek tomu sa vzácne vyskytnú prípady s nehodnotiteľným výsledkom imunohistochemického vyšetrenia (tzv. neinterpretovateľný farbiaci vzor) [53].

MSI môže byť detegovaná pomocou PCR techník a fragmentačnou analýzou zisťujúcou dĺžku určitého segmentu DNA v poškodenom tkanive a porovnáva ju s rovnakými segmentami v normálnom tkanive, ktoré je priľahlé k tumoru. Na tieto účely je potrebné tkanivo fixované vo formole a pre dermatopatologickú prax toto vyšetrenie predpokladá využitie mikrodisektoru na získanie optimálneho výsledku. Jednoduchšou a z praktického hľadiska výhodnejšou alternatívou získania kontrolnej vzorky je odber periférnej krvi pacienta (5-10 ml), ktorá môže byť tiež použitá na detekciu zárodočnej mutácie. V súčasnosti najviac používaný panel mikrosatelitových markerov zahŕňa D2S123, D5S346, D17S250, BAT25, BAT26 (viď. tabuľka 2). V našej praxi navyše používame aj NR21, NR24, a MONO27. Výsledkom analýzy môžu byť dva fenotypy MSI, a to mikrosatelitová nestabilita vysokého (high degree of MSI; MSI-H) (obr. 13) a nízkeho stupňa (low degree of MSI; MSI-L) [54]. Zatiaľ čo MSI-H u sporadických sebaceóznych kožných lézií a u sebaceóznej hyperplázie je detegovaná len vzácne, u ostatných kožných lézií pacientov s MTS je častým nálezom [54, 39, 34, 52].

Zárodočná mutácia v MMR génoch môže byť detegovaná u pacienta a jeho pokrvných príbuzných viacerými metódami, napr. testom na prítomnosť skrátených proteínov (proteín truncation test), analýzou konformačného polymorfizmu jednoreťazcových segmentov (single strand conformation polymorphism analysis, SSCP), analýzou heteroduplexov. U pacientov s MTS je zárodočná mutácia v MMR génoch detegovaná v 60 – 70 % [34, 3]. Na našom pracovisku je používaná PCR metóda s následnou priamou sekvenáciou korešpondujúcich PCR fragmentov slúžiacou k detekcii malých mutácií (obr. 14) a MPLA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ktorá umožňuje detekciu rozsiahlych delécií a duplikácií. Súčasťou genetického vyšetrenia je i test na onkogénnu V600E (predtým známu ako V599E) hotspot mutáciou v géne BRAF. Tato metóda spolu s vyšetrením MSI bola nedávno pridaná k prospektívnemu skríningu pacientov s kolorektálnym karcinómom, u ktorých bolo vyslovené podozrenie na HNPCC/Lynchov syndróm. BRAF mutácia je identifikovaná vo významnej časti kolorektálnych karcinómov s MSI-H s hypermetyláciou MLH1 promótora (tzv. sporadické karcinómy), ale nie je prítomna u tumorov s MSI vznikajúcich v rámci HNPCC/Lynchovho syndrómu. Zjednodušene zhrnuté- identifikácia V600E BRAF mutácie prakticky vylučuje možnosť HNPCC/Lynchovho syndrómu, a možno ju preto použiť pred samotným testovaním zárodočnej mutácie v MLH1 géne u kolorektálnych karcinómov s MSI-H [55].